Активний опір політичній реформації церкви чинив печерський архімандрит Никифор Тур (1590-1599 рр.), при ньому монастир підпорядковувався Константинопольському патріархові і отримав підтвердження праваставропігії.

Після смерті Никифора Тура, у вересні 1599 р., братія обрала печерським архімандритом активного захисника православ'я ігумена Пінського Ліщинського монастиря Єлисея Плетенецького. Залишаючись протягом майже 25 років печерським архімандритом, Єлисей Плетенецький багато зробив для зміцнення авторитету монастиря, розширення його володінь та удосконалення побуту і монастирських порядків. Під час його архімандритства було відреставровано Успенський собор, відремонтовано лікарню для бідних, започатковано книгодрукування у Лаврі.

У боротьбі проти насаджування католицизму й унії значну роль відіграла лаврська друкарня, яку було засновано у 1615 р. Навколо неї збуралися визначні громадські діячі, літератори, вчені та художники-гравери. Серед них - Єлисей Плетенецький, Памва Беринда, Захарія Копистенський, Іов Борецький, Петро Могила, Афанасій Кальнофойський, Інокентій Гізель та багато інших. У лаврській друкарні побачили світ розкішно оправлені й прикрашені гравюрами Житія святих, Євангелія, Акафісти, Псалтирі, букварі, календарі, твори з історії церкви, в тому числі "Часослов" (1616 р.), "Тератургіма" (1638 р.) Афанасія Кальнофойського, "Требник" (1645 р.) Петра Могили, "Патерик Печерський" (1661 р.), "Синопсис" (1674 р.) Інокентія Гізеля. До середини XVIII ст. лаврська друкарня практично не мала конкурентів. Завдячуючи праці таких граверів як Ілля, Л.Тарасевич, Д.Галяховський, А.Козачківський та інших, гравюра досягла високого професійного рівня, стала широко відомим жанром мистецтва. Видання Києво-Печерської друкарні користувались популярністю не тільки завдяки поліграфії та ілюстраціям, але й вишуканістю зовнішнього оформлення.

Видатне місце в історії монастиря посідає архімандрит, а згодом Київський митрополит Петро Могила. Це був активний церковний діяч, далекозорий та мудрий правитель. Однією з головних сфер діяльності Петра Могили, спрямованої на зміцнення позицій православної церкви, стало піклування про освіту. У 1631 р. митрополит Петро Могила заснував у Києво-Печерській лаврі гімназіон, в якому поряд з богослов'ям вивчались і світські предмети: граматика, риторика, геометрія, арифметика. У 1632 р. для підготовки православного духівництва та світської еліти в Україні, гімназіон було об'єднано з Братською школою на Подолі. Був створений перший вищий учбовий заклад в Україні - Києво-Могилянський колегіум. Митрополит Петро Могила приділяв також значну увагу діяльності печерської друкарні.

У XVII ст., з відродженням і укріпленням позицій Православної церкви на Україні, постало питання офіційноїканонізації Печерських святих. 1619 року архімандрит Києво-Печерського монастиря Захарія Копистенський, редагуючи до видання у лаврській друкарні Святкову Мінею (Анфологіон) помістив поруч із вселенськими та загальноруськими святими імена 24 печерських, раніше місцевошанованих іноків. Святитель Петро Могила, бувши лаврським архимантдритом, а згодом митрополитом Київським, почав клопотання про отримання офіційного дозволу Константинополя на канонізацію Печерських святих. 1643 року в Києві був укладений "Канон Печерським Святим", який поступово набув рис офіційного церковного маніфесту, що проголошував вшанування українських угодників і, передусім, печерських чорноризців. Він нараховує 74 імені, з яких 41 належало лаврським святим (39 із Ближніх печер і 2 - з Дальніх).

Тільки у 1762 р. російська церква проголосила Печерських святих загальноросійськими. Формування сучасного лаврського пантеону тривало значний час і остаточно завершилося у другій половині XVIII ст. Пантеон святих склали 73 преподобних у Ближніх печерах і 45 - у Дальніх.

Під час боротьби українського народу за національне визволення у 1648-1654 рр. Києво-Печерський монастир неодноразово зазнавав нападів і руйнацій. Неоднозначним було ставлення вищого українського православного духовенства до приєднання України до Росії. Українських ієрархів лякала перспектива втрати церковної, економічної і особистої незалежності. Для вищого православного духівництва, очолюваного київським митрополитом Сильвестром Косовим, доцільніше було залишатися під юрисдикцією Константинопольського патріарха, ніж переходити під владу патріарха Московського. Це було однією з причин того, що українські православні ієрархи були проти приєднання України до Росії. Сильвестр Косів та печерський архімандрит Йосиф Тризна спочатку відмовилися привести киян і ченців до присяги на вірність московському царю. І лише під тиском частини козаків, що підтримували Переяславську угоду, Йосиф Тризна 19 січня 1654 р. був змушений провести акт присяги в Успенському соборі.

Після смерті 1656 р. Йосифа Тризни лаврська братія обрала своїм архімандритом вихованця Петра Могили Інокентія Гізеля. Він очолював монастир у важкий час (1656-1684), коли його земельні володіння спустошували татари, а численні пожежі знищили значну частину рукописів і лаврських видань.

Навесні 1686 р. у Москві було укладено з Польщею так званий Вічний мир і взаємний союз проти Туреччини. Тяжким наслідком цієї угоди стало підпорядкування Московському патріархату Української православної церкви, що на кілька століть позбавило її самостійності.

Намагаючись здобути прихильність українського духівництва, яке було налаштоване проти скасування Москвою його давніх прав і вольностей, царський уряд почав надавати найбільшим українським монастирям, зокрема й Лаврі, жалувані грамоти, кошти, землі та маєтки. Тому наприкінці XVII - початку XVIIІ століть. феодально-кріпосне господарство Лаври сягнуло найбільших розмірів. На той час у володінні монастиря було три міста, сім містечок, 120 сіл і хуторів з 56-ти тисячами кріпаків. У вотчинах монастиря нараховувалось кілька сотень промислових підприємств і торговельних закладів.

У XVII ст. у Лаврі були проведені значні будівельні та ремонтно-реставраційні роботи. Архітектурний ансамбль поповнився мурованими церквами: святого Миколая в Больницькому монастирі, над печерами з'явилися Аннозачатіївська, Різдва Богородиці та Хрестовоздвиженська церкви. Тоді ж було зведено кам'януТрапезну палату з церквою. Коштом гетьмана Івана Мазепи навколо Верхньої території Лаври спорудженофортечний мур з чотирма вежами і трьома брамами, церква Всіх Святих над Економічною брамою.

У ніч з 21 на 22 квітня 1718 р. у келії намісника Лаври Варлаама Голенковського виникла пожежа, що знищила всі дерев'яні будівлі та пошкодила кам'яні споруди. Загинуло чимало церковних цінностей, коштовні тканини, постраждали вироби з дорогоцінних металів, лаврська бібліотека.

З 1720 р. розпочалися значні відбудовчі роботи, які тривали майже півстоліття. В цей період в українському мистецтві, зокрема в архітектурі, склався своєрідний стиль, що отримав назву українського бароко. Саме у цьому стилі відновлюються та оздоблюються Успенський собор, Троїцька надбрамна церква. Інтер'єри Успенського собору та Троїцької надбрамної церкви у 30-х роках XVIII cт. розписали кращі лаврські художники - Алімпій Галік, Іван Максимович, Феоктист Павловський, керував живописними роботами майстер Стефан Лубенський. Принципи, що лягли в основу монументальних розписів цих храмів стали визначальним взірцем для наступних розписів церков та монастирів України. Дивовижні архітектурні пам'ятки, високохудожні твори живопису та декоративно-прикладного мистецтва виконували такі видатні майстри як Степан Ковнір, Никифор Горох, інжинер-будівельник В.Новгородцев, зодчі І.Григорович-Барськийта Стрембицький, архітектори Ф.Васильєв, П.Неєлов, Й.Шедель та багато інших.

Таким чином до середини XVIII ст. у мальовничому амфітеатрі дніпрових схилів склався архітектурний комплекс Києво-Печерської лаври, який зберігся до нашого часу. При забудові території було вдало використано природний ландшафт: на верхньому плато - пам'ятки Верхньої Лаври, на схилі гори - споруди Ближніх печер, а на південному пагорбі - архітектурний ансамбль Дальніх печер.