Церква, побудована на початку XII ст., була частиною системи давніх оборонних споруд Печерського монастиря. На сьогодні вона є єдиною давньоруською пам’яткою Києво-Печерської лаври, яка майже без пошкоджень пережила монгольську навалу 1240 р. і всі подальші випробування.

У нижньому ярусі пам’ятки розташовані Святі врата – головний вхід в Києво-Печерський монастир, у верхньому – невелика за розмірами (10×9 м) церква. Належить до поширеного в Київській Русі типу храмів – однобанний, хрестовокупольний, чотиристовпний. У церкві відсутні хори. Первинно не було й притвору, а вхід влаштовано з північного боку. За часів пізнього середньовіччя Троїцька церква стала головним храмом Больницького монастиря, при якому діяли богадільня і лікарня для ченців.

За доби бароко зовнішній вигляд храму зазнав суттєвих змін – у кінці ХVІІ ст. з північного боку до нього прибудували притвор, у першій половині ХVIII ст. фасади прикрасили ліпним орнаментом, баня стала грушоподібною і позолоченою. У 20–30-х рр. ХVIII ст. змінився й інтер’єр храму – стіни було розписано в стилі українського бароко, встановлено триярусний дерев’яний іконостас. У 1900–1902 рр. фасади Троїцької церкви розписали лаврські художники під керівництвом В. Соніна. Періодично поновлювані реставраторами, ці розписи прикрашають храм донині.

У 1920-х рр. в приміщенні церкви влаштували пункт політпросвіти, а після Другої світової війни, наприкінці 1950-х рр., її відкрили для відвідувачів.